原文作者:陈晓南 朱彦

如今在药物发现的开始阶段,会应用基于机制的高通量筛选方法,从具有大于10万个不同结构的分子库中筛选活性化合物,紧随其后会进行严格的安全性评价。一般从5 000~10 000个化合物中才能得到一个可以上市的药物,这需要耗时12~15 a,花费10~20亿美元[1]。如果能提早发现某些药物的毒性作用,就会显著地降低研发过程中的经济风险。

目前,药物的心脏毒性评价主要应用动物模型、动物离体心脏、动物原代心肌细胞及经过修饰的可传代细胞株H9C2,不仅通量低,而且存在种属差异。人诱导多能干细胞分化的心肌细胞(hiPSC-CM)与人正常体内心肌细胞的特征相似,克服了种属间差异,而且可以无限增殖,缩减了药物研发过程中的时间和成本,为药物心脏毒性高通量筛选提供了宝贵的生物细胞资源[2-3]。hiPSC-CM已用于高内涵成像、全自动膜片钳、微电极阵列、实时无标记细胞分析等实验技术,推动了药物体外心脏毒性高通量筛选评价方法的发展,也将加快中医药现代化进程。


1、hiPSC-CM研究背景

从1990-2013年,美国、欧洲、亚洲总共有81个药物由于安全问题撤出市场,其中会造成心律失常的药物就有16个[4]。此外,从1997年至今,由于具有心脏毒性而撤出市场的药物从5.1%上升到33.3%[5]。由于心毒性是药物研发过程中导致失败的重要原因,在药物发现初期,加强心脏安全性的筛选将会很有帮助。

当前药物研发过程中,药物的高淘汰率要归咎于所用实验方法检测结果的不准确性。例如很多毒理实验用小鼠作为实验对象,然而小鼠与人之间的种属差异是非常大的。小鼠的心跳速率是人类的10倍(500 bpm vs 60 bpm),心电图时程仅是人类的1/5~1/10(50~100 ms vs 450 ms)[6]。小鼠心肌细胞的复极阶段由Ito、IK、slow1、IK、slow2、ISS构成,而人类心肌细胞复极阶段电流包括IKr、IKs、Ik1等[7]。从分子层面看,调控分子、受磷蛋白和结构基因的表达也存在差异。在人心脏中,α和β肌球蛋白重链(α-/β-MHC)分别在心房和心室表达,而α-MHC在小鼠心房和心室中均表达;小鼠肌球轻链蛋白MLC2a和MLC2v的分布也不同于人。信号调节蛋白SIRPA只在人体内表达。这些差异使得小鼠对37%的药物的耐受性要比人类高出10倍[8]

人类原代心肌细胞的生理环境与体内相似,但是由于来源少、细胞一致性较差、几乎没有增殖能力而且体外培养时会去分化,因此不可能得到大规模培养和广泛应用。人胚胎细胞诱导得到细胞株,如人胚胎肾细胞(HEK)解决了人心肌细胞不能传代的问题。HEK细胞可以转染需要研究的药物靶点,使其在细胞内高表达,从而用于药物筛选,如hERG通道表达在HEK细胞中用于评价药物是否会阻断hERG通道而导致心律失常[9]。来自人体的细胞株虽然解决了种属差异及不可传代的难题,但是细胞株所反映的只是药物与脱离真实环境的通道蛋白的相互作用,并没有提供药物作用的更复杂环境。例如,维拉帕米是hERG通道阻滞剂,如果仅以此标准判断,维拉帕米会被认为是会造成心律失常的药物,但是由于它同时也会作用于L型钙通道而不会造成心律失常[10]。这种情况,如果仅应用稳定转染hERG通道的细胞株进行实验,也许会淘汰掉一个潜在的有前景的药物。

因此,科研学者投入相当大的精力探索药物心脏安全性评价更加可靠的方法,其中就包括hESC-CM和hiPSC-CM。与hESC-CM相比, hiPSC-CM不使用胚胎细胞或卵细胞, 获得相对容易且不存在伦理学问题,因此更具应用价值和发展前景。


2、hiPSC诱导分化的心肌细胞

诱导多能干细胞(iPSC)最初是日本科学家山中伸弥于2006年利用病毒载体将4个转录因子(Oct4, Sox2, Klf4和c-Myc)的组合转入分化的小鼠体细胞中,使其重编程而得到的类似胚胎干细胞和胚胎APSC多能细胞的一种细胞类型[11]。2007年他们又利用同样的技术将人的皮肤成纤维细胞诱导成为hiPSC[12]。hiPSC不仅在细胞的形态、生长特性、干细胞的标志物表达等方面与胚胎干细胞几乎完全相同,而且在DNA的甲基化方式、基因表达谱、染色质的状态、形成嵌合体动物等方面也与胚胎干细胞相似。hiPSC可诱导分化为各种细胞,如心肌、神经、胰腺、骨等多种体细胞和不同的组织,用于疾病治疗、药物发现和安全性评价。现在从骨髓、骨骼肌、胎儿和成人心肌、脂肪组织、脐带组织中都能诱导获得hiPSC-CM[13],其形态结构、基因表达、离子通道表达量及功能、动作电位和收缩特点与人心肌细胞相似[14]。hiPSC-CM将为心血管领域疾病与药物研究带来革命性变化。

心血管疾病和药物研究需要体外诱导hiPSC分化为心肌细胞,使其获得与人体心肌细胞相似的自然生理信号通路。诱导hiPSC分化心肌细胞的因素有WNT蛋白家族、转化生长因子(TGF-β)、成纤维细胞生长因子(FGF)和激活素A(Activin A)等[15-19]。这些细胞因子都会促进hiPSC向心肌细胞分化。也有报道称化学小分子或有机化合物也会促进hiPSC向心肌细胞分化,如组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂曲古抑菌素A(TSA),抗坏血酸,电刺激或机械刺激[20-22]。从基因表达水平来看,hiPSC-CM的SCN5A、HCN4、CJA1、MYH6、MYH7等心肌特异性基因与人心肌细胞表达量相近[23]。从蛋白表达情况来看,hiPSC-CM表达心肌特异性的因子及结构蛋白。许多必须的收缩蛋白、胞间连接结构、受体、钙相关蛋白及动作电位中的离子通道都正常表达,比如兰尼碱受体,心肌肌浆网Ca2+-ATP酶,钠通道(SCN5A),电压门控钙通道(CACNA1C),电压门控钾通道(KCN4A和KCNH2)。电生理方面,hiPSC-CM动作电位模式与心肌细胞相同[24]。更重要的是hiPSC-CM对激素刺激有应激,对异丙肾上腺素和氨甲酰胆碱分别有加强和减弱细胞收缩的反应[25]。在CIPA推动下,已有一些研究者将iPSC-CM应用于药物心脏毒性实验,与稳定转染hERG通道的细胞株相比,iPSC-CM能更好的预测药物诱导的心律失常[26-27]。CIPA的最终目的是要用iPSC-CM代替临床前动物心毒性评价模型。在不久的将来,iPSC-CM很可能将会在临床实验前就将具有心毒性的药物淘汰掉。因此hiPSC-CM是目前药物心脏毒性筛选的理想工具。

hiPSC-CM是未成熟的心肌细胞,结构和电生理特性与幼稚型心肌细胞相似。hiPSC-CM的生长培养时在培养皿底,与三维生长的心房心室细胞的复杂结构相比,功能还是相对较弱。科学家应用许多基因或非基因手段及组织工程学的方法使hiPSC-CM接近成熟状态[28]


3、应用hiPSC-CM的药物心脏毒性高通量筛选方法

在体外药物心脏安全性评价中,将hiPSC-CM应用到已有或创新的评价方法中需要一定的探索过程。目前已有一些高通量的实验方法通过检测hiPSC-CM的表型结构、电生理特征、胞内钙离子流及收缩性来筛选淘汰掉潜在的心脏毒性化合物。


3.1 高内涵荧光成像

高内涵成像技术可以评价细胞的一系列生理学特征,如细胞数目、细胞形态、细胞增殖、细胞膜完整性、吞噬作用、细胞凋亡、细胞迁移、细胞器健康(如细胞核、线粒体、溶酶体)等。高内涵仪器一般都是高度自动化的,如Opera(Perkin Elmer),ImageXpress(Molecular Devices),BD pathway(BD Biosciences),应用96、384、1 536孔板实现高通量筛选。Mioulane等[29]应用hiPSC-CM和高内涵成像实验建立了的体外药物心毒性筛选方法[29]。他们用一组荧光染料Vybrant FAM caspases 3和7、TMRM、ToPRO-3和Hoechst 33342(Invitrogen)检测细胞核改变、线粒体状态、细胞凋亡和坏死;可以观察到hiPSC-CM对药物白屈菜红碱浓度依赖的由凋亡到坏死的转变,以及时间依赖的细胞从凋亡到坏死的形态变化。美国CDI公司应用高内涵成像量化了缬氨霉素,依托泊苷和鱼藤酮造成的hiPSC-CM的线粒体和溶酶体生理改变、DNA损伤和氧化应激反应。Sirenko等[30]的工作更加突出,他们应用钙敏感的荧光染料CalceinAM处理细胞,应用ImageXpress监测细胞内钙离子流的变化,因为钙离子的变化与细胞收缩跳动节奏一致,因此可以用来计算跳动次数、跳动幅度及其他参数,同时结合FLIPR监测一些阳性药如利多卡因、丁卡因抑制钠通道。硝苯地平,依拉地平,维拉帕米抑制钙通道及西沙比利,多非利特抑制hERG通道后细胞跳动频率的变化,实验结果与文献报道相近,证实了Sirenko等建立此方法的准确性。而且基于荧光染料的高内涵成像实验成本低,通量高,每天可产生50 000个数据。以上这些结果说明,hiPSC-CM应用于高内涵成像高通量检测药物的心毒性已经成为现实。


3.2 全自动膜片钳实验

在过去的10年,全自动膜片钳逐渐发展起来,技术上取得了很大的进展。除了能够记录异源表达的电流,全自动膜片钳技术还能够记录内源性的电流,例如胚胎干细胞(ESC)或者诱导多能干细胞(iPSC)诱导的心肌细胞中的电流[31-32]。Nadine等[31]优化了应用全自动膜片钳Patchliner(Nanion)记录iPSC-CM电流的实验方法,确定了实验需要的最佳细胞数目。在记录出hiPSC-CM动作电位后,给予10 µmol/L L型钙通道的激动剂BayK8644,动作电位延长。10 µmol/L TTX给药后,没有动作电位产生,洗脱之后,动作电位恢复正常,证实用Patchliner记录到hiPSC-CM的电流完全符合电生理特征。Olaf等[33]同样用全自动膜片钳验证了hiPSC-CM的电生理特征。1 µmol/L和10 µmol/L硝苯地平抑制hiPSC-CM动作电位时程APD90至49.8%和40.8%。0.1 µmol/L西沙比利延长APD90至176.2%。10 µmol/L TTX抑制APD90至80.4%。这说明应用全自动膜片钳开展心脏毒性药物筛选技术已经成熟。

目前,自动膜片钳的结果还不能达到手动膜片钳那样精确,它自动封接细胞及自动加药系统使得每天能产生10 000个数据[34]。对于操作熟练的实验人员,全自动膜片钳的成功率会达到60%~80%,对于缺乏经验的操作者,成功率低于50%也并不稀奇。实验失败的原因一般归结于细胞质量,包括细胞膜的性质,细胞消化的质量以及细胞表达目的通道的百分率。全自动膜片钳需要消化细胞,这样也许会破坏细胞间网络,是否会改变hiPSC诱导的心肌细胞的离子电流目前仍无定论。


3.3 微电极阵列场电位测量

微电极阵列(MEA)标测技术是一种中通量的实验手段,用来测量多细胞的场电位。心电图Q-T间期延长是预示致心律失常危险的重要指标, 而心室肌细胞动作电位时程或应用MEAs技术记录到的细胞外场电位时程(FPD)能直接反映Q-T间期延长状况。实验证明场电位时程和动作电位时程密切相关[35]。微电极阵列标测技术已经成功应用于hiPSCs诱导的细胞来预测QT间期延长和心律失常[26]。8个工具药(hERG通道阻滞剂:E-4031、西沙比利;hERG和钠通道阻滞剂:氟卡尼、美西律、奎尼丁、特非那定;钙通道阻滞剂:硝苯地平、维拉帕米)用MEA方法研究对hiPSC-CM离子通道的抑制作用并和已存在和研究数据进行比较[27]。这项研究表明,基于hiPSC-CM的MEA实验数据与目前功能心脏电生理数据一致,这种实验方法提供了可靠的药物心毒性高通量筛选策略。

微电极阵列实验可以长时间、同步标测多细胞标本的电活动情况, 对于研究细胞间电信号的传导机制问题具有一定的优势。弥补了膜片钳技术存在的不足(研究多局限于单个心肌细胞,不能反映细胞间电活动传导状况,对细胞而言有创,难以进行长时程检测),可在组织水平上完成心脏生理和病理状态下电激动传导方面的实验研究。


3.4 实时无标记细胞分析技术

实时无标记细胞分析技术(RTCA)是一种建立在阻抗基础上的瞬时细胞电感应连续记录系统,能够无标记的检测心肌细胞的收缩周期,动态监测心肌细胞的收缩性,能够灵敏定量地检测到心肌功能的离子和非离子通道调节器的效应,因此可以用来评估某些药物的临床前心脏安全性,也为筛选出潜在的心脏毒性药物提供了一种相对高通量和方便的途径。一项实验研究应用人类iPSC诱导的心肌细胞检测49个阳性药、阴性药物及空白对照在RTCA实验对心肌细胞收缩的影响,结果显示空白对照的可信度为74%,阳性药的可信度为78%,阴性药物的可信度为95%[36],根据欧洲实验代替方法的验证标准(European Centre for the Validation of Alternative Methods criteria),RTCA实验具有很好的预测能力。正是应用RTCA实验发现了阿霉素降低心脏跳动频率,从而进一步研究发现阿霉素会影响线粒体功能[37]

与MEA实验相同,RTCA可以在细胞正常培养的条件下进行实验,无需对细胞消化处理等步骤。在最接近生理状态下很快获得检测结果。自动连续检测,可获取全过程动态信息,实验方法简单易行,实验参数相对较少,数据处理快速方便。


4、展望

药物研发的不同阶段,心脏毒性是导致药物研发失败的重要原因。基于hiPSC-CM的药物心毒性高通量筛选技术逐渐成熟,将大大减少药物研发的成本,提高药物研发效率。

中药是中华民族长期积累沉淀下来的宝贵财富,中药新药研究是个高投入、高风险的行业,由于中药具有量效关系复杂、多靶点等特征, 使得中药很难摆脱粗、大、黑的禁锢[38]。目前中国中药新药研制的整体水平不高,忽视了发展创新和基础研究[39-40]。运用高新技术手段探讨中药作用的物质基础、作用机制及毒性反应监测是中药新药研究的发展趋势。目前基于hiPSC的中药研究还没有报道,将hiPSC应用于中药新药及大品种二次开发研究中,使现有的动物证候模型不断趋向人的证候模型改进,hiPSC有分化为各种人体细胞的潜能,将基于hiPSC药物研发和筛选技术应用于天然药物研究, 既是对hiPSC技术应用的完善, 又是将这一技术应用于天然药物研究的有益尝试[41]

辨证论治是中医特色和优势所在,中药新药的临床疗效如何,取决于对证候治疗的效果,但目前缺乏针对证候治疗的有效手段。目前心血管疾病的精准医疗和心脏毒性个体化辨识均可获益于hiPSC技术的完善和推广[42]。从患者获得的hiPSC可产生大量受该疾病影响的细胞,这些细胞可用于构建体外疾病模型, 许多疾病特异性的细胞系已被成功建立,如扩张型心肌病,肥厚型心肌病,致心律失常性右室心肌病,Duchenne型肌营养不良症,糖尿病心肌病,ALDH2缺乏症,心肌炎[43-49]。充分利用中医药的理论及实践基础,基于hiPSC的体外疾病模型定会为中医辨证论治理念指导下精准医疗提供新思路。


2018年11月06日

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